13ª Semana Integrada do Instituto de Física de São Carlos

Desvendando a interação entre as septinas humanas e a toxina botulínica

21 de ago. de 2023 16:00

1h 30m

Salão de Eventos USP

Normal 16h00 - 17h30

Descrição

As neurotoxinas botulínicas (BoNT) são toxinas potentes que podem levar a sintomas graves de botulismo, mas que também têm sido utilizadas com sucesso no tratamento de distúrbios neurológicos e terapias cosméticas. Os efeitos terapêuticos do tipo A da BoNT (BoNT/A) duram de 3 a 12 meses. No entanto, os mecanismos que governam a ação de longa duração da BoNT/A nas células neuronais são pouco compreendidos. De fato, a estabilização da cadeia leve da BoNT/A (LCA) pode ser resultado de sua ligação física a proteínas citoesqueléticas relativamente estáveis, como septinas, mas uma interação direta entre elas ainda não foi demonstrada. (1-2) O objetivo deste trabalho é centrado em produzir tanto a LCA quanto septinas humanas recombinantes, a fim de determinar e caracterizar a potencial interação. Para isto, a expressão das proteínas foi realizada em células E. coli Rosetta (DE3). A LCA foi expressa em fusão com GST (GST-LCA) e a SEPT7 com uma His-tag. Assim, após a purificação das proteínas, a interação pode ser avaliada por ensaios de pulldown. A GST-LCA imobilizada na resina de afinidade foi capaz de resgatar o complexo SEPT2-6-7, demonstrando de fato a interação in vitro entre as proteínas. Para melhor definir qual as regiões envolvidas na interação, foram produzidas construções truncadas de todas as proteínas. Os resultados dos ensaios usando o complexo SEPT2-6-7allΔC (destituído dos domínios C terminais) não resgataram a LCA. Porém, o complexo SEPT2ΔC-6-7 (excluindo apenas o C- terminal de SEPT2) foi capaz de resgatar a LCA. Assim, pode ser determinado que os C terminais são as regiões responsáveis pela interação com a LCA, mas que apenas SEPT6 e SEPT7 estão envolvidas. Para definir melhor a região específica de interação, construções utilizando apenas os C terminais de SEPT6 e SEPT7 foram produzidas e estão sendo ensaiadas para avaliar a afinidade da interação septina-LCA. Em conjunto, os resultados demonstraram, pela primeira vez, uma interação direta da LCA com o complexo hexamérico formado por SEPT2-6-7 e dependente da presença dos domínios C-terminais de SEPT6 e SEPT7. Este trabalho está sendo apoiado pela CAPES e FAPESP (2020/02897-1).

Referências

1 CAVINI, I. A. et al. The structural biology of septins and their filaments: an update. Frontiers in Cell and Developmental Biology, v. 9, p. 765085-1-765085, 2021.

2 VAGIN, O. et al. Recruitment of septin cytoskeletal proteins by botulinum toxin A protease determines its remarkable stability. Journal of Cell Science, v. 127, pt. 15, p. 3294-3308, 2014.