Descrição
Em maio de 2022, a Organização Mundial da Saúde (OMS) foi informada de um caso confirmado da varíola do macaco causada pelo vírus Monkeypox (MPXV) no Reino Unido, e após isto, houve uma rápida disseminação da doença em outros países. (1) O MPXV, pertence ao gênero Orthopoxvirus, família Poxviridae e apresenta DNA de fita dupla. (2) Esse vírus possui duas polimerases essenciais, uma DNA polimerase (DNApol) e uma RNA polimerase dependente de DNA (DdRp). A DNApol é um complexo catalítico que possui 3 subunidades proteicas, que juntas estabilizam a holoenzima, são elas, F8, A22 e E4. (3) Além disso, essa enzima é um importante alvo molecular, por ser essencial tanto na replicação viral quanto na síntese precoce no processo de infecção. Obter a DNA polimerase do vírus MPXV com suas 3 subunidades, com alto grau de rendimento e solubilidade, visando caracterizá-las funcionalmente através da padronização de ensaios cinéticos e estruturais. Os genes para expressão em E.coli das subunidades F8, A22 e E4 foram sintetizados comercialmente em vetores pET28a. Para expressão em células de inseto S. frugiperda (Sf9) foram desenhados primers para a subclonagem em diferentes vetores (pFastBac-6Hzb, pFastBac-Bse e pFastBac-CT10) visando analisar o melhor processo de purificação. Esses vetores permitem a expressão da proteína alvo fusionada à proteína 6Hzb; à uma cauda de histidinas no N-terminal e à uma cauda de histidinas no C terminal, respectivamente. Os vetores pET28a contendo o gene das subunidades F8, A22 e E4 foram ressuspendidos em água autoclavada na concentração de 50 ng/µl, 2 µl foram utilizados para transformar cepas de E. coli BL21, BL21 Star e Rosetta. Observou-se o aparecimento de colônias isoladas após 24 horas, que foram inoculadas em meio LB seletivo contendo 50 µg/mL de kanamicina. Os plasmídeos foram recuperados utilizando o Kit Fast-n-Easy Plasmid mini-prep e serão utilizados para amplificação e posterior subclonagem dos genes em vetores de expressão em células Sf9, caso seja necessário. As cepas transformadas serão submetidas à teste de expressão em pequena escala, variando o meio de expressão (LB – Luria Bertani, TB - Terrific Broth e ZYM - meio auto indutor) e a concentração de IPTG (0,25 mM, 0,5 mM e 1M). Após os testes de expressão, será possível avaliar rendimento e solubilidade das proteínas alvo, estabelecendo um protocolo otimizado de expressão e assim seguir para os testes de purificação e padronização dos ensaios cinéticos.
Referências
1 BOING, A. C. et al. Monkeypox: o que estamos esperando para agir? Revista Brasileira de Epidemiologia, v. 25, p. e220020-1e220020-3, 2022.
2 CLARO, I. M. et al. Shotgun metagenomic sequencing of the first case of monkeypox virus in Brazil. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, v. 64, p. e48-1-48-4, 2022.
3 PENG, Q. et al. Structure of monkeypox virus DNA polymerase holoenzyme. Science, v. 379, n. 6627, p. 100-105, 2022.
| Certifico que os nomes citados como autor e coautor estão cientes de suas nomeações. | Sim |
|---|---|
| Palavras-chave | Monkeypox. DNA polimerase. Inibidores. |
| Orientador e coorientador | Orientador: Prof. Dr. Glaucius Oliva. Coorientadora: Dra. Juliana Roberta Torini |
| Subárea 1 | Biofísica |
| Subárea 2 (opcional) | Cristalografia |
| Agência de Fomento | FAPESP |
| Número de Processo | 2023/04660-7 |
| Modalidade | MESTRADO |
| Concessão de Direitos Autorais | Sim |
