13ª Semana Integrada do Instituto de Física de São Carlos

Descoberta de inibidores do complexo RNA polimerase dependente de RNA (RdRp) de SARS-CoV-2 como candidatos a compostos líderes para covid-19.

21 de ago. de 2023 10:30

1h 30m

Salão de Eventos USP

Básica 10h30 - 12h00

Descrição

Os vírus emergentes com potencial pandêmico representam uma ameaça constante para a saúde pública global. A infecção humana pelo novo coronavírus, COVID-19, resultou em uma pandemia sem precedentes. Até maio de 2023, foram registrados mais de 670 milhões de casos confirmados e mais de 6,8 milhões de mortes em todo o mundo. (1) O SARS-CoV-2 é um vírus de RNA de cadeia simples e polaridade positiva. Após entrar na célula, seu genoma viral é usado como mRNA para sintetizar poliproteínas virais pelos ribossomos, que são então clivadas por proteases para gerar proteínas não estruturais. Em seguida, são produzidos RNAs subgenômicos que impulsionam a produção de novos RNAs genômicos e proteínas estruturais necessárias para a formação de novos vírus. Esse processo de transcrição/replicação viral é mediado por um complexo de replicase composto por subunidades de proteínas não estruturais (nsp7-nsp12-nsp8), sendo a enzima nsp12 uma RNA polimerase dependente de RNA fundamental nesse complexo. A RNA polimerase dependente de RNA (RdRp) é um alvo promissor para fármacos antivirais devido à sua natureza exclusivamente viral e alto grau de conservação estrutural em comparação com outros coronavírus. (2) A proteína RdRp (nsp12) foi expressa em células de inseto usando o sistema de Baculovírus e posteriormente purificada em três etapas de cromatografia. As proteínas cofatoras foram expressas em sistema bacteriano e purificadas em dois passos de cromatografia. A atividade da polimerase, isoladamente e em complexo, foi avaliada usando uma técnica de medição direta que monitora o alongamento de um RNA modelo, utilizando a fluorescência de uma sonda intercalante (SYBR Green I - SGI). A formação do complexo aumenta consideravelmente a eficiência do processo de alongamento da cadeia peptídica. Até o momento, aproximadamente 160 compostos com potencial inibitório foram testados contra o complexo replicase. Esses compostos foram obtidos de coleções comerciais e da biblioteca disponível em nosso grupo. Alguns desses compostos já foram descritos na literatura como inibidores de RdRp de outros vírus, como Zika e Chikungunya. A maioria dos compostos testados não inibiu a atividade do complexo replicase, no entanto, identificamos quatro moléculas que demonstraram inibição promissora com valores de IC50 na faixa de baixo micromolar (0,9 a 6,0 µM). Os ensaios de deslocamento térmico (Differential Scanning Fluorimetry – DSF) revelaram alterações significativas na temperatura de fusão (Tm) da proteína em sua forma apo, em comparação com a proteína incubada com cada um desses quatro ligantes (3 a 20°C), indicando que a proteína apresenta afinidade pelos ligante. Esses resultados abrem caminho para a descoberta de novos inibidores de RdRp como candidatos a fármacos antivirais.

Referências

1 YIN, W. et. al. Structural basis for inhibition of the RNA-dependent RNA polymerase from SARS-CoV-2 by remdesivir. Science, v. 368, n. 6498, p. 1499-1504, 2020.

2 LIPSITCH , M.; SWERDLOW, D. L.; FINELLI, L. Defining the epidemiology of Covid-19 : studies needed. New England Journal of Medicine, v. 382, n. 13, 1194-1196, 2020.