Nona Semana Integrada do Instituto de Física de São Carlos

Estudos estruturais de glicosiltransferases envolvidas na síntese de biofilmes em Enterococcus faecalis

Não agendado

20m

Doutorado

Palestrante

Lívia Oliveira Dantas Clementino

Descrição

A habilidade de ser resistente a antibióticos por parte de bactérias não é algo recente (1), geneticamente, vários mecanismos que conferem resistência bacteriana a antibióticos produzidos atualmente também eram verificados em cepas de épocas passadas. Entretanto, bactérias com resistência a antimicrobianos estão sendo selecionadas rapidamente pelo uso excessivo e irregular de antibióticos. Torna-se então importante estudar vias e outros fatores que conferem resistência bacteriana. Neste trabalho, o foco de estudo é determinar a estrutura e função específica de duas glicosiltransferases (GT) de E. faecalis, epaI e epaOX, participantes do cluster gênico epa (enterococcal polysaccharide antigen), um conjunto de genes que expressam proteínas responsáveis pela síntese e exportação de polissacarídeos que ficam ancorados no peptidoglicano da bactéria. Os genes epaI e epaOX codificam proteínas as quais estão envolvidas na síntese de biofilmes. (2-3) Biofilmes atuam como proteção natural para as bactérias que por eles são envolvidas, facilitam a transferência horizontal de genes, favorecendo a aquisição de resistência bacteriana à antibióticos. O gene da enzima epaI foi amplificado a partir de uma biblioteca de gDNA de E. faecalis, enquanto o gene da enzima epaOX foi sintetizado com códons otimizados para a expressão em E. coli. Os genes foram clonados em vetor pET-Trx1A. Cepas de expressão Rosetta (DE3), Artic, C43, pLEMO21 e pLysS foram usadas em testes de expressão das enzimas como tentativa de otimização da solubilidade dessas glicosiltransferases, assim como a expressão de formas truncadas das sequências proteicas. Por enquanto não foi possível observar melhora da solubilidade das GTs quando expressas nas cepas testadas. O truncamento epaI 130 foi o mais promissor, porém, ele ainda carrega outro problema encontrado com as GTs, a não exposição da cauda de histidina, o que dificulta a cromatografia por afinidade em resina de níquel, e, consequentemente, o rendimento da proteína. O uso de detergentes como CHAPS e Triton x-100 foi aplicado para auxiliar na solubilização das proteínas, o que recupera fração considerável da proteína, entretanto, como ainda não é possível verificar se as proteínas se mantêm nativas através de testes enzimáticos pela falta de conhecimento sobre as reações específica que elas catalisam, outras soluções estão sendo consideradas para resolver esse problema.

Referências

1 PAWLOWSKI, A. C. et al. A diverse intrinsic antibiotic resistome from a cave bacterium. Nature Comunications, v. 7, n. 13803-1-13803-10. Dec. 2016. doi: 10.1038/ncomms13803.
2 DALE, J. L. et al. Restructuring of Enterococcus faecalis biofilm architecture in response to antibiotic-induced stress. Biofilms and Microbiomes, v. 3, p. 15-1-15-9, 2017. doi: 10.1038/s41522-017-0023-4.
3 DALE, J. L. et al. Multiple roles for Enterococcus faecalis glycosyltransferases in biofilm-associated antibiotic resistance, cell envelope integrity, and conjugative transfer. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 59, n. 7, p. 4094-4105. July 2015.