Palestrante
Descrição
O vírus da febre amarela possui genoma composto por uma única fita de RNA e pertence à família Flaviviridae, que inclui dengue, zika e hepatite C. Apesar do histórico da doença, ainda não existe nenhum medicamento para seu tratamento. No Brasil, a doença se mantinha contida com a vacinação, no entanto, um surto recente entre 2016-2018, recolocou a febre amarela como preocupação de saúde pública, com risco de espalhar-se novamente no ambiente urbano. O genoma viral codifica uma única poli proteína que contém três proteínas estruturais e sete não estruturais. A NS3 tem dois domínios: um domínio protease e um domínio helicase/NTP-ase. A NS3 protease age juntamente com uma outra proteína não estrutural como cofator, a NS2B, que auxilia o enovelamento correto da NS3 protease e permite que tenha uma forma ativa. O complexo NS2B-NS3 protease auxilia na clivagem da poli proteína imatura, liberando as proteínas formadoras do complexo de replicação viral. Considerando a importância deste complexo no ciclo de replicação viral, é evidente que ele representa um importante alvo no planejamento de potenciais candidatos antivirais. Sendo assim, o objetivo principal deste projeto é a elucidação da estrutura cristalográfica do complexo NS2B-NS3 protease da linhagem circulante do vírus da febre amarela e sua utilização na busca por potenciais candidatos antivirais. Inicialmente, amplificamos a região codificante da proteína NS2B-NS3 protease utilizando como molde o cDNA viral, gentilmente cedido pela Dra. Myrna Bonaldo (Fiocruz). (1) A sequência amplificada foi clonada no vetor de expressão pET_SUMO pelo método de clonagem independente de ligação (LIC), seguida da inserção de um linker (G4SG4) entre o cofator NS2B e o domínio protease. A proteina foi purificada e utilizada para cristalização. A coleta de dados foi realizada no Diamond Light Source e a resolução da estrutura feita utilizando o método de substituição molecular. Por fim, avaliamos a atividade da proteína foi realizado um ensaio baseado na fluorescência do AMC liberado pela atividade proteolítica da enzima na presença do substrato Bz-nKRR-AMC. (2) Dos cristais obtidos a partir da proteína purificada, após a coleta dos dados de difração foi possível obter um conjunto de dados que nos possibilitou resolver a estrutura cristalográfica, e assim obtivemos o modelo final da estrutura da NS2B-NS3 protease a 2.9 Å, a qual encontra-se na conformação fechada e ativa. Além disso, a enzima demonstrou elevada atividade proteolítica no ensaio de atividade, condizente com a conformação estrutural obtida, o que nos permitiu padronizar um ensaio de atividade que terá suma importância na busca por inibidores da enzima. Subsequentemente, pretendemos aplicar o método de SBDD, aliado aos ensaios enzimáticos.
Referências
1 BONALDO, M. C. et al. Genome analysis of yellow fever virus of the ongoing outbreak in Brazil reveals polymorphisms. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 112, n. 6, p. 447-451, jun. 2017.
2 LI, Y. et al. Structural insights into the inhibition of Zika virus NS2B-NS3 protease by a small-molecule inhibitor. Structure, v. 26, n. 4, p. 555-564.e3, Apr. 2018.
| Subárea | Cristalografia |
|---|---|
| Apresentação do trabalho acadêmico para o público geral | Não |
