Palestrante
Descrição
A maioria dos genes dos eucariotos contém éxons e íntros. A retirada dos íntrons para formar o mRNA maduro é chamado splicing e consiste de duas reações de transesterificação catalisadas pelo spliceossomo. O spliceossomo é composto de cinco ribonucleoproteínas U1, U2, U4/U6 e U5. Foi visto que a U5102K forma um subcomplexo com a U515K e é importante para a formação de um complexo chamado U4/U6.U5 trisnRNP.(1) O estudo desse complexo em levedura mostrou que a Dib1(U515K) tem uma localização central no U4/U6.U5 trisnRNP, associando-se ao U5 snRNA, ao pré mRNA e ao domínio N terminal da Prp8. Tanto a Dib1 quanto a Prp8 estão associadas a estabilização do hairpin formado pela parte invariante do U6 snRNA e estudos recentes sugerem que a Dib1 bloqueia a formação de interações RNA-RNA e proíbe a interação dos componentes do NTC e os movimentos das proteínas para a formação do complexo B ativado.(2)Já a Prp43 é uma helicase que atua no final do processo de splicing, participando da desmontagem do spliceossomo.(3) Esse trabalho tem por objetivo o estudo do trans splicing em T. brucei, mais especificamente, o estudo estrutural e funcional das proteínas específicas da partícula U5 snRNP, U515K e U5102K e da proteína Prp43. Para o estudo estrutural da U515K, foram feitas mutações sitio dirigidas em sua alça flexível (U515K truncada), a proteína foi purificada por afinidade, seu enovelamento foi avaliado por Dicroísmo Circular e Fluorimetria Diferencial de Varredura e foram feitos testes de cristalização. Para o estudo dos efeitos da autoclivagem, foram realizadas mutações independentes nas quatro serinas do C terminal e uma na região do ponto de clivagem. Também foi feita a clonagem da U5102K e da Prp43 em pc_PTP_neo para estudos de parceiros de interação e de uma porção do N terminal da U5102K em pET SUMO para o estudo da interação dessa proteína com a U515K. As mutantes foram expressas em Bl21 (DE3), foi feita a purificação por afinidade e seus enovelamentos foram avaliados por Fluorimetria Diferencial de Varredura. Os testes de clivagem com as mutantes mostraram que apenas a substituição da serina 137 apresentou inibição da autoglivagem, sugerindo que ela seja o resíduo catalítico. Na mutante U515Kpc foi vista a manutenção da atividade de clivagem, o que sugere que a clivagem ocorra na alanina que não foi modificada e que a substituição dos aminoácidos ao seu redor por alaninas não interfira nessa atividade. Também foram realizados testes de criatalização com a mutante U515K137A. Nenhum dos testes resultou na formação de cristais. Quanto ao estudo do subcomplexo 15K-102K, o N terminal da U5102K foi expresso em BL21 (DE3) e foi feita a purificação por afinidade, tentou-se visualizar a interação com a U515K por gel nativo, mas os resultados foram inconclusivos. A purificação dos parceiros de interação da U5102K pela técnica de PTPtag não mostrou novas proteínas, já o experimento com a Prp43 resultou na identificação da Ntr1. Mais experimentos devem ser feitos com a Ntr1 para avaliar sua participação no trans splicing.
Referências
1 DA SILVA, M. T. A. et al. New insights into trypanosomatid U5 small nuclear ribonucleoproteins. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz v.106, n. 2, p. 130-138, 2011.
2 SCHREIB, C. C. et al. Functional and biochemical characterization ofDib1's role in pre-messenger RNA splicing. Journal of Molecular Biology, v. 430, n. 11, p. 1640-1651, 2018.
3 FOURMANN, J. B. et al. Regulation of Prp43-mediated disassembly of spliceosomes by its cofactors Ntr1 and Ntr2. Nucleic Acids Research, v. 45, n. 7, p. 4068-4080, 2017.
| Subárea | Cristalografia |
|---|---|
| Apresentação do trabalho acadêmico para o público geral | Não |
