Nona Semana Integrada do Instituto de Física de São Carlos

Caracterização estrutural das enzimas da via de biossíntese da vitamina B6 em Staphylococcus aureus

Não agendado

20m

Doutorado

Palestrante

Angélica L. C. Barra

Descrição

Segundo a Organização Mundial de Saúde, as doenças infecciosas são a terceira causa de morte no mundo e número de casos de infecções por microrganismos multi-resistentes é crescente. Staphylococcus aureus, é uma bactéria gram-positiva que está entre os principais patógenos causadores de infecções no mundo, os chamados ESKAPE. No Brasil e em outros países da América do Sul mais de 50% dos casos de infecção por S. aureus são devidos a cepas resistentes à meticilina (MRSA). (1) Esses dados evidenciam a alarmante necessidade de se identificar novos alvos moleculares para o planejamento de novos candidatos a antibióticos. Com o avanço do sequenciamento completo de genomas, foi possível descobrir proteínas e vias metabólicas conservadas em microrganismos mas ausente em humanos, o que os torna alvos ideais para o desenvolvimento de novos antimicrobianos. (2) Dentre estas está a via de síntese de novo da vitamina B6 (piridoxal fosfato), que atua como cofator para diversas enzimas do metabolismo de carboidratos e aminoácidos de procariotos e eucariotos. A síntese é realizada por duas enzimas (Pdx1 e Pdx2) que atuam em conjunto, formando um complexo multimérico. A enzima Pdx2 atua como uma glutaminase e transfere uma molécula de amônia para Pdx1 que juntamente com a ribose 5-fosfato e o gliceraldeído 3-fosfato sintetiza o piridoxal fosfato. (3) O complexo enzimático de alguns patógenos já foi caracterizado, como de Bacillus subtilis (PDB: 2NV2), mas de S. aureus não. Deste modo, o objetivo desse trabalho é caracterizar estruturalmente o complexo SaPdx1/SaPdx2 assim como as enzimas isoladas de S. aureus. Para isso, as proteínas foram expressas separadamente em E. coli Rosetta (DE3) e purificadas por cromatografia de afinidade a níquel. Em seguida, as proteínas recombinantes foram clivadas com a protease Tobacco Etch Virus (TEV) para a remoção da tag e submetidas a uma cromatografia de exclusão molecular. Foi realizada uma triagem de condições de cristalização com as proteínas purificadas utilizando kits de soluções comerciais. Os ensaios foram realizados com o auxílio de um robô de cristalização, pelo método de difusão de vapor em gota sentada em placa de 96 poços. Ambas as proteínas foram bem expressas e purificadas mas, por enquanto, foi realizada a triagem de cristalização apenas de SaPdx1. Cresceram cristais em várias condições do kit Morpheus® e dados de difração foram coletados na linha MX2 do Laboratório Brasileiro de Luz Síncroton (LNLS, Campinas). Para resolução da estrutura de SaPdx1 foi utilizado o método de substituição molecular por meio dos pacotes XDS e CCP4. O refinamento da estrutura está em andamento assim como as triagens de cristalização de SaPdx2. Após a resolução das estruturas será possível iniciar os ensaios de docagem molecular para identificação de ligantes e posteriormente possíveis inibidores destas enzimas.

Referências

1 LEE, A. S. et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Nature Reviews Disease Primers, v. 4, p. 18033-1-18033-23, May 2018. doi: 10.1038/nrdp.2018.33.
2 DREBES, J. et al. MRSA infections: from classical treatment to suicide drugs. Current Medicinal Chemistry, v. 21, n. 15, p. 1809-1819, 2014.
3 MÜLLER, I. B. et al. The assembly of the plasmodial PLP synthase complex follows a defined course. PLoS ONE, v. 3, n. 3, p. e1815-1-e1815-9, 2008.