Palestrante
Descrição
A reação de polimerização em cadeia (do inglês, PCR) é uma técnica muito usada em laboratórios de biologia molecular, análise forense, diagnóstico clínico e indústrias alimentícias. Taq DNA polimerase de Thermus aquaticus é a enzima mais amplamente usada na PCR, apesar de poder apresentar amplificações inespecíficas e formação de dímeros de oligonucleotídeos devido à sua atividade residual em temperatura ambiente, na qual a maioria das reações é preparada. (1-2) Para solucionar esse problema, foram desenvolvidas Taq DNA polimerases que são ativadas somente após uma incubação em alta temperatura (do inglês, Hot Start Taq DNA polymerase). Essas enzimas são, frequentemente, ligadas à biomoléculas ou grupamentos químicos que impedem a sua atividade a temperatura ambiente. Com a incubação em altas temperaturas, ou ciclo Hot Start, as biomoléculas ou grupamentos químicos se desligam da DNA polimerase, que recupera a sua atividade. (3) Apesar de muito utilizada, apenas um único tipo de Taq DNA polimerase Hot Start é produzida no Brasil, fazendo com que o valor e a disponibilidade dessa enzima sejam desfavoráveis. Dessa forma, esse trabalho – realizado em colaboração com a empresa Cellco Biotec do Brasil LTDA – visa à produção e o estudo de Taq DNA polimerases Hot Start de alta qualidade, por técnicas de mutagênese, ligação a anticorpo/aptâmero, reação com grupamentos químicos e precipitação de íons divalentes do meio reacional. Para isso, a Taq DNA polimerase foi produzida heterologamente em Escherichia coli e teve sua purificação otimizada através de quatro etapas cromatográficas. Para a produção das Taq DNA polimerases Hot Start por ligação a aptâmero e anticorpo, diluições de aptâmero de DNA e anticorpo foram misturados à enzima nativa. Na versão Hot Start por modificação química, derivados de anidrido maleico foram ligados covalentemente à enzima, em diversas proporções molares. Já no tampão Hot Start, foram testados agentes tamponantes com base em íons fostato que promovem a precipitação do cofator enzimático Mg+2. Após a otimização de cada metodologia, as DNA polimerases Hot Start foram comparadas em eficiência, sensibilidade, tamanho do fragmento amplificado, baixa atividade a 25 ºC, amplificação de fragmentos de DNA com alta porcentagem de GC, amplificações de genes de alta complexidade, desempenho em PCR multiplex e especificidade. Não foi observada a diminuição da atividade a 25 ºC na enzima mutante, enquanto que todas as outras mostraram-se Hot Start. A polimerase modificada quimicamente apresentou eficiência menor do que a enzima nativa. Todas as outras polimerases Hot Start apresentaram resultados semelhantes aos da enzima nativa, com destaque para o alto desempenho da enzima ligada à anticorpo em PCRs de DNAs ricos em GC e da enzima quimicamente modificada nos ensaios de especificidade e PCRs multiplex. Dessa forma, foi possível produzir diversas Taq DNA polimerases Hot Start e mapear as suas características para definir a melhor aplicação de cada enzima, o que irá ajudar a diminuir o custo e o prazo de entrega para a pesquisa e diagnóstico brasileiros.
Referências
1 ISHINO, S.; ISHINO, Y. DNA polymerases as useful reagents for biotechnology - the history of developmental research in the field. Frontiers in Microbiology, v. 5, p. 465-1-465-8, Aug. 2014. doi: 10.3389/fmicb.2014.00465.
2 CHIEN, A.; EDGAR, D. B.; TRELA, J. M. Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus. Journal of Bacteriology, v. 127, n. 3, p. 1550-1557, Sept. 1976.
3 LEBEDEV, A. V. et al. Hot start PCR with heat-activatable primers: a novel approach for improved PCR performance. Nucleic Acids Research, v. 36, n. 20, p. e131-1-e131-18, Nov. 2008.
| Subárea | Biotecnologia Molecular |
|---|---|
| Apresentação do trabalho acadêmico para o público geral | Não |
